介紹

全球七百萬人患有不同聽力損失（度1，2）。順鉑化療導(dǎo)致聽力40不敵癌癥患者和阻礙的語言能力在年輕個(gè)體（發(fā)展60％的3 - 5）。在現(xiàn)代社會(huì)中，由于噪聲暴露水平的不斷提高，由噪聲引起的聽力損失正變得越來越突出。盡管進(jìn)行了廣泛的研究，但迄今為止，還沒有獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的藥物來防止噪音，順鉑，抗生素或與年齡有關(guān)的聽力損失。大多數(shù)候選在臨床前和臨床試驗(yàn)?zāi)壳盎衔锱c抗氧化劑，維生素，炎癥和代謝谷胱甘肽，如硫代硫酸鈉（STS），?乙酰半胱氨酸，D -甲硫氨酸，和地塞米松（1，2，6）。例如，STS是順鉑的直接滅活劑和抗氧化劑，在順鉑化療后6小時(shí)給藥，成功地將局限性標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)險(xiǎn)性肝母細(xì)胞瘤患兒的聽力損失發(fā)生率降低了48％，但降低了已治療的散播患者的生存率腫瘤（7 – 9）。類固醇地塞米松已被證明可用于治療耳毒性噪聲（只是部分有效10，11）。

我們通過開發(fā)一個(gè)不帶偏見，表型的高通量篩選（HTS），以確定小分子發(fā)起的這項(xiàng)工作，對(duì)鉑毒性（提供保護(hù)12，13）。蛋白激酶是特別有吸引力的治療靶標(biāo)，因?yàn)樗鼈冋{(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞功能，許多激酶抑制劑已被FDA批準(zhǔn)用于人類治療，因此，作為聽力損失的治療劑具有巨大潛力。蛋白激酶磷酸化級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)體內(nèi)所有細(xì)胞類型中的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，抑制這些途徑也可能影響內(nèi)耳中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。使用源自小鼠耳蝸的永生細(xì)胞系，并在模仿非有絲分裂細(xì)胞生長的緩慢生長條件下培養(yǎng)（不含γ-干擾素的HEI-OC1）（14），我們以劑量反應(yīng)模式篩選了162種激酶抑制劑，并確定了命中率最高的達(dá)拉非尼（TAFINLAR）。達(dá)布拉非尼是一種有效的選擇性BRAF激酶小分子抑制劑，可口服生物利用并獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療多種具有激活的BRAF的癌癥（BRAF V600E或V600K突變），例如黑色素瘤，小細(xì)胞肺癌，甲狀腺和膽道癌（15 – 18）。

BRAF是Raf絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員。它在RAS / RAF / MEK [有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶] / ERK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（也稱為MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的一部分）中起重要作用，并參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活（19）。此途徑在人類癌癥（大約三分之一失調(diào)20，21）。BRAF的磷酸化激活的MEK蛋白，這反過來，激活該磷酸化多種底物包括核轉(zhuǎn)錄因子（下游ERK蛋白激酶22，23）。BRAF在小鼠內(nèi)耳起始在胚胎18.5天（E18.5）檢測(cè)，并在有絲分裂后耳蝸毛細(xì)胞（HCS）和支持細(xì)胞（SC）（檢測(cè)24，25）。先前已經(jīng)報(bào)道了磷酸-ERK的表達(dá)是上調(diào)在機(jī)械和噪聲損傷（小鼠內(nèi)耳26 - 28），并且可以是蜂窩信號(hào)，其感測(cè)細(xì)胞損傷和觸發(fā)器細(xì)胞死亡。因此，抑制BRAF的耳毒性損害可以揭示該信號(hào)通路在有絲分裂后耳蝸細(xì)胞中的新作用。

重新使用FDA批準(zhǔn)的藥物最近已成為藥物開發(fā)中一種特別有吸引力且有效的替代方法，并且?guī)追N抗癌藥物被用于新的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥（29）。與新的化學(xué)實(shí)體（10到15年且超過20億美元）相比，重新用途的藥物具有較短的開發(fā)時(shí)間（5至8年），上市成本降低40％（https://ncats.nih.gov/preclinical/重新用途）。基于達(dá)布拉非尼在人類使用中的大量信息，可以將其快速應(yīng)用于人類的聽力保護(hù)和治療臨床試驗(yàn)。達(dá)拉非尼作為一種具有耳保護(hù)作用的治療藥物具有幾個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)：（i）達(dá)拉非尼是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的口服藥物，無疑是在普通人群中給藥的最便捷途徑，并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人類口服。我們可以在此處測(cè)試聽力保護(hù)范圍內(nèi)的劑量。（ⅱ）Dabrafenib穿透血-腦屏障（30，31），其類似于血-迷路屏障（32）。這種穿越血液迷宮屏障的獨(dú)特性能克服了聽力障礙藥物開發(fā)的主要障礙之一。（iii）達(dá)拉非尼已開發(fā)為抗癌藥（16 – 18）本身并不太可能是抗氧化劑化合物，因此在某些類型的腫瘤中具有不干擾甚至協(xié)同順鉑殺死腫瘤的功效的潛力。（iv）達(dá)拉非尼在聽力保護(hù)和治療領(lǐng)域影響著一種新的生物學(xué)靶標(biāo)BRAF激酶途徑。鑒于對(duì)BRAF / MEK / ERK途徑的特定和有效抑制劑作為抗癌藥的研究很多，因此在此途徑和其他途徑中使用多種激酶抑制劑的聯(lián)合治療可以在更低，更低毒性的劑量下提供更好的保護(hù)。Dabrafenib（BRAF抑制劑）和trametinib（MEK抑制劑）的聯(lián)合治療目前用于黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的治療，并且比單獨(dú)dabrafenib更有效地抑制該途徑（18，33）。以前，我們已經(jīng)確定CDK2抑制劑作為候選治療劑為聽力損失（13，34）。因此，達(dá)拉非尼和AZD5438（CDK2抑制劑）的組合可提供更好的抗耳毒性功效，并降低一般毒性。

在這里，我們首先驗(yàn)證了dabrafenib和三種其他的BRAF抑制劑，兩種MEK1 / 2抑制劑以及一種ERK1 / 2特異性抑制劑在順鉑誘導(dǎo)的小鼠耳蝸外植體中的毒性，并測(cè)試了dabrafenib單獨(dú)或dabrafenib聯(lián)合AZD5438預(yù)防順鉑的功效-以及在成年小鼠模型中經(jīng)口傳遞時(shí)產(chǎn)生的噪聲引起的聽力損失。我們的研究結(jié)果表明，當(dāng)順鉑和噪聲侵害時(shí)，BRAF激酶以及BRAF / MEK / ERK和CDK2通路在應(yīng)激激活和誘導(dǎo)有絲分裂后耳蝸細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵作用。這種早期的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)在耳蝸SC中被激活，并被BRAF / MEK / ERK激酶的小分子抑制劑所減弱。

結(jié)果

達(dá)布拉非尼在小分子激酶抑制劑篩選中名列前茅

針對(duì)順鉑耳毒性（保護(hù)性化合物的無偏屏幕12，13）用的是永生化的內(nèi)耳細(xì)胞系HEI-OC1從小鼠耳蝸（派生進(jìn)行14）。以劑量反應(yīng)模式篩選了一百六十二種獨(dú)特的小分子激酶特異性抑制劑，以保護(hù)免受50μM順鉑的傷害。使用一種方案量化caspase-3 / 7活性測(cè)定法，以測(cè)量凋亡，該方案可量化源自caspase-3 / 7底物裂解的發(fā)光產(chǎn)物（Caspase-Glo 3/7試劑）。單獨(dú)使用順鉑處理的細(xì)胞定義為100％的發(fā)光，未處理的細(xì)胞定義為0％的發(fā)光（圖1A，圖S1，表S1和補(bǔ)充材料中的數(shù)據(jù)集）。

圖1 在細(xì)胞系和人工耳蝸外植體模型中，達(dá)布拉非尼可防止順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

（A）使用HEI-OC1細(xì)胞系以劑量-反應(yīng)模式進(jìn)行基于細(xì)胞的小分子篩選；命中定義為在50μM順鉑存在下可使caspase-3 / 7活性降低50％或更多的化合物。單獨(dú)使用培養(yǎng)基（綠點(diǎn)），單獨(dú)使用順鉑（紅色點(diǎn)）和化合物+順鉑（灰色點(diǎn)）。（B）在存在50μM順鉑的情況下，來自caspase-3 / 7分析的達(dá)拉非尼劑量反應(yīng)曲線（A）（藍(lán)色），以及單獨(dú)的HEI-OC1細(xì)胞中達(dá)拉非尼的細(xì)胞滴度-Glo劑量反應(yīng)曲線（紅色）。（C）達(dá)布拉非尼的分子結(jié)構(gòu)。（D）dabrafenib（Dab）在經(jīng)或未經(jīng)順鉑處理的P3 FVB小鼠耳蝸外植體中的劑量反應(yīng)。在將順鉑（150μM）加入治療24小時(shí)（紫色）的P3 FVB耳蝸外植體之前1小時(shí)，添加單獨(dú)的培養(yǎng)基（黑色），單獨(dú)的順鉑（白色），單獨(dú)的Dab（綠色）或Dab。每個(gè)條中的數(shù)字表示每次處理計(jì)數(shù)的外植體數(shù)量。用鬼筆環(huán)肽染色計(jì)數(shù)每160μm耳蝸中轉(zhuǎn)區(qū)域的外毛細(xì)胞（OHC）數(shù)量，與單獨(dú)的順鉑（紅色）和單獨(dú)的培養(yǎng)基相比，平均值±SEM，** P<0.01，*** P <0.001 （黑色）通過Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行單向方差分析（ANOVA）。（E）顯示了用單獨(dú)的介質(zhì)，60μMDab，150μM順鉑或3μMDab和150μM順鉑處理24小時(shí)后的鬼筆環(huán)肽染色的整裝中途轉(zhuǎn)向人工耳蝸外植體的典型共聚焦圖像。

通過Cell Titer-Glo細(xì)胞活力測(cè)定法進(jìn)一步表征所有化合物，以確定單獨(dú)的化合物在HEI-OC1細(xì)胞中的毒性（表S1和補(bǔ)充材料中的數(shù)據(jù)集）。熱門產(chǎn)品包括四種BRAF特異性抑制劑：甲磺酸達(dá)拉非尼，維拉非尼，PLX-4720和RAF-265。在所測(cè)試的化合物中，選擇達(dá)布拉非尼作進(jìn)一步表征是因?yàn)樗哂锌诜锢枚龋現(xiàn)DA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和間變性甲狀腺癌，EU批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌，因?yàn)樗梢源┰窖X屏障（15 - 18，35，36）。達(dá)拉非尼在中位抑制濃度下顯示出對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用（IC 50）在caspase-3 / 7分析中為13.47μM），并且在細(xì)胞活力分析中測(cè)試的所有濃度下對(duì)HEI-OC1細(xì)胞無毒（圖1，B和C）。其他BRAF抑制劑在微摩爾范圍內(nèi)的IC 50相似，并且對(duì)細(xì)胞無毒（表S1）。

達(dá)布拉非尼和其他MAPK抑制劑可防止順鉑誘導(dǎo)的小鼠耳蝸外植體HC死亡

小鼠人工耳蝸外植體被廣泛認(rèn)為是體內(nèi)人工耳蝸模型的替代品，并且對(duì)于實(shí)用的藥物篩查是實(shí)用的（37）。接下來，我們使用經(jīng)過dabrafenib預(yù)處理1小時(shí)，然后進(jìn)行24小時(shí)150μM順鉑處理的P3-P4 FVB小鼠耳蝸外植體來表征dabrafenib的保護(hù)作用，并計(jì)算每160μm存活的外部HC（OHC）的數(shù)量。單獨(dú)使用中藥，單獨(dú)使用藥物和單獨(dú)使用順鉑作為對(duì)照。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，達(dá)拉非尼具有保護(hù)作用，IC 50為30 nM，中位致死劑量（LD 50）> 60μM，治療指數(shù)（TI）定義為LD 50 / IC 50，> 2000（圖1，D和E; 請(qǐng)參閱“材料和方法”中的“耳蝸外植體”部分，以比較外植體和細(xì)胞系中的IC 50 s。

接下來，我們?cè)噲D通過測(cè)試額外的打擊最大的激酶特異性抑制劑來保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的耳蝸外植體細(xì)胞死亡，以進(jìn)一步驗(yàn)證BRAF和MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是否為我們的目標(biāo)。在經(jīng)典的MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，BRAF直接磷酸化并激活MEK，而MEK進(jìn)而磷酸化并激活ERK（圖2A）（38）。其他三個(gè)BRAF抑制劑威羅菲尼（39），PLX-4720（40），和RAF-265（41，42）顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的OHC損失與IC 50 / TI的200納米/ 15.0，250納米/ 12.0，3分別為nM / 666.7（圖2，B至D）。兩種其他MEK抑制劑曲美替尼（43）和mirdametinib（44）以及ERK特異性抑制劑AZD0364（45）分別以100 nM / 40.0、500 nM / 6.0和5 nM / 200.0的IC 50 / TI給予了顯著的順鉑保護(hù)（圖2）。 ，E到H）。此外，F(xiàn)DA批準(zhǔn)以1:80的摩爾比給藥的dabrafenib和曲美替尼的組合常規(guī)用于治療BRAF突變的癌癥，因?yàn)樗蛔C明可以有效增強(qiáng)BRAF途徑的抑制作用并增加患者的生存率（18，33）。我們?cè)趤喿罴褲舛鹊耐庵搀w模型中測(cè)試了這種組合，其中兩種藥物都不具有顯著的保護(hù)作用，但是組合的化合物對(duì)順鉑誘導(dǎo)的OHC丟失具有顯著的保護(hù)作用（圖2G）。所有化合物的鬼筆環(huán)肽染色組織的共聚焦圖像如圖2所示。S2。請(qǐng)注意，對(duì)于所有在耳蝸外植體中用順鉑處理過的化合物，我們都觀察到了高斯曲線：在低濃度下沒有保護(hù)作用，在高濃度下，該化合物與順鉑組合對(duì)HCs有毒。在一起，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了BRAF及其下游效應(yīng)子是預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的耳毒性的治療靶標(biāo)。達(dá)布拉非尼的所有化合物均優(yōu)于按IC 50進(jìn)行測(cè)試的化合物（30 nM;圖1D），除了RAF-265和AZD0364更有效外，但由于達(dá)布拉非尼的FDA地位，最佳TI（> 2000）和通過血腦屏障的通透性，我們繼續(xù)使用該化合物用于體內(nèi)測(cè)試。

圖2 其他熱門的BRAF和MAPK抑制劑可防止外植體中順鉑的耳毒性。

（A）推定的BRAF / MEK / ERK細(xì)胞途徑和該途徑中的小分子蛋白激酶抑制劑是我們內(nèi)耳細(xì)胞系篩選中的熱門藥物，可防止順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。BRAF抑制劑vemurafenib（B），PLX-4720（C）和RAF-265（D）; MEK1 / 2抑制劑mirdametinib（E），trametinib（F）以及dabrafenib和trametinib的組合（G）; 和ERK1 / 2抑制劑AZD-0364（H）在耳蝸外植體培養(yǎng)試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，以防止順鉑引起的OHC死亡。單獨(dú)使用培養(yǎng)基（黑色），單獨(dú)使用順鉑（白色），單獨(dú)使用化合物（綠色）或在將順鉑（150μM）添加至處理24小時(shí)（紫色）的P3 FVB耳蝸外植體之前1小時(shí)添加化合物。每個(gè)條中的數(shù)字表示每次處理計(jì)數(shù)的外植體數(shù)量。用鬼筆環(huán)肽染色計(jì)數(shù)每160μm耳蝸中轉(zhuǎn)區(qū)域的OHC數(shù)量，平均值為±SEM，與單獨(dú)的順鉑（紅色）和單獨(dú)的培養(yǎng)基相比，* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001 （黑色）通過Bonferroni事后測(cè)試進(jìn)行單向方差分析。

此外，為了將達(dá)拉非尼與目前參與臨床試驗(yàn)的其他藥物進(jìn)行基準(zhǔn)比較，我們將其IC 50和TI與先前報(bào)道的使用相同P3 FVB外植體模型的化合物進(jìn)行了比較。包括肯帕龍，STS，依布硒啉，D-蛋氨酸和地塞米松，其IC 50 / TI分別為0.2μM/ 150、2.1μM/ 285、10.8μM/ 1.4、98.4μM / 1.0和> 0.25μM/ 20。 （13，46）。相比之下，達(dá)拉非尼比所有其他化合物更有效且具有更大的TI，這表明它是成年小鼠進(jìn)一步體內(nèi)測(cè)試的極佳候選者。

達(dá)拉非尼可阻斷順鉑誘導(dǎo)的MAPK磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)

由于達(dá)拉非尼是HEI-OC1細(xì)胞和耳蝸外植體中順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的有效抑制劑，因此我們接下來在這些模型中證明了BRAF及其下游靶點(diǎn)的順鉑激活。將HEI-OC1細(xì)胞用50μM順鉑處理（用于caspase-3 / 7篩選的濃度相同）處理30分鐘，1小時(shí)和5小時(shí)，然后通過Western blot分析全細(xì)胞裂解液。發(fā)現(xiàn)順鉑隨時(shí)間增加BRAF，MEK和ERK的磷酸化，從而使其活化，而在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ERK磷酸化均顯著增加（圖3A）。然后用濃度遞增的dabrafenib預(yù)處理細(xì)胞，使其IC 50分別達(dá)到1x，2.5x和5x。在HEI-OC1細(xì)胞中。用化合物處理細(xì)胞1小時(shí)，然后用50μM順鉑處理1小時(shí)，以確定dabrafenib通過Western blot阻斷順鉑誘導(dǎo)的信號(hào)變化的能力。單獨(dú)使用最高測(cè)試濃度的達(dá)布拉非尼治療作為對(duì)照。盡管與對(duì)照細(xì)胞相比，順鉑再次增加了BRAF，MEK和ERK的磷酸化，但達(dá)拉非尼以劑量依賴性的方式減輕了這些變化（圖3B）。

圖3 達(dá)拉非尼減輕了順鉑激活的BRAF信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

（A）在50μM順鉑處理30分鐘，1小時(shí)和5小時(shí)后，HEI-OC1細(xì)胞中BRAF，ERK和MEK磷酸化的代表性Western印跡圖像。將磷酸化的蛋白條帶歸一化為β-肌動(dòng)蛋白，取平均值，即平均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，采用Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行單向ANOVA。n =4。（B）代表性蛋白質(zhì)印跡圖像（n達(dá)拉非尼（14、35或75μM）和順鉑（50μM）在HEI-OC1細(xì)胞中聯(lián)合處理后= 3）BRAF，ERK和MEK磷酸化。在進(jìn)行1小時(shí)的順鉑處理之前，先用dabrafenib預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)。單獨(dú)使用培養(yǎng)基，單獨(dú)使用順鉑和單獨(dú)使用75μM達(dá)拉非尼作為對(duì)照。將磷酸化的蛋白條帶歸一化為β-肌動(dòng)蛋白，取平均值，用Bonferroni事后檢驗(yàn)通過單向ANOVA進(jìn)行±SEM，* P <0.05，*** P <0.001。? = 3（?）代表性的鬼筆環(huán)肽（紅色）和磷酸化ERK（pERK）（綠色）染色的P3 FVB整裝中轉(zhuǎn)小鼠耳蝸外植體經(jīng)3μMdabrafenib（Dab）預(yù)處理1小時(shí)（共10分鐘順鉑（150μM）暴露）的共聚焦圖像。帶有標(biāo)記箭頭的Deiters細(xì)胞（DC）和內(nèi)指骨細(xì)胞（IPhC）。n = 6耳蝸。（D）代表性的鬼筆環(huán)肽（紅色）和pERK（綠色）染色的P3 FVB整裝中轉(zhuǎn)小鼠耳蝸外植體用3μMdabrafenib（Dab）預(yù)處理10小時(shí)順鉑（150μM）暴露前的共聚焦圖像。如下所示的鄰區(qū)，其中OHC用白色箭頭標(biāo)識(shí)，內(nèi)部HC（IHC）用黃色箭頭標(biāo)識(shí)，pERK陽性DC和IPhC用標(biāo)記箭頭標(biāo)識(shí)。? = 6耳蝸。

因?yàn)樵贓RK中觀察到信號(hào)的顯著變化，所以用150μM順鉑處理P3-P4 FVB耳蝸外植體10分鐘，30分鐘和1小時(shí)，然后對(duì)鬼筆環(huán)肽和磷酸化ERK（pERK）進(jìn)行染色。然后通過共聚焦顯微鏡對(duì)組織樣品成像。在10分鐘時(shí)觀察到ERK的快速磷酸化，隨后在30分鐘和1小時(shí)時(shí)信號(hào)降低。值得注意的是，pERK信號(hào)最初是在SC中觀察到的，尤其是Deiters'（DC）和內(nèi)指骨細(xì)胞（IPhC）區(qū)域，而不是HCs，并傳播到周圍細(xì)胞中（圖3C）。為了確定達(dá)拉非尼是否能阻止順鉑誘導(dǎo)的ERK活化，我們用3μM達(dá)拉非尼預(yù)處理了耳蝸外植體1小時(shí)，然后與順鉑接觸10分鐘。盡管未經(jīng)處理的耳蝸表達(dá)低水平的pERK，但在DC和IPhC區(qū)再次觀察到順鉑誘導(dǎo)的ERK磷酸化，而達(dá)拉非尼治療阻止了ERK的活化（圖3D）。）。為了驗(yàn)證順鉑處理后在SC中而不是在HC中是否激活ERK，我們將外植體與僅標(biāo)記HC的肌球蛋白VIIa染色，并顯示激活ERK的細(xì)胞與被HC特異性染色的細(xì)胞之間沒有重疊標(biāo)記（圖S3）。綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明順鉑是MAPK磷酸化級(jí)聯(lián)的有效誘導(dǎo)劑，而達(dá)拉非尼則減輕了順鉑激活途徑。

達(dá)布拉非尼在體內(nèi)可預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)HC丟失

斑馬魚的側(cè)線神經(jīng)質(zhì)是研究藥物對(duì)順鉑或氨基糖苷毒性的保護(hù)的公認(rèn)模型，因?yàn)樗鼈兊腍C被認(rèn)為與哺乳動(dòng)物HCs同源，并且在體內(nèi)容易被化合物吸收（47 – 49）。正如我們?cè)谥暗难芯恐?，在檢查MI1（內(nèi)側(cè)神經(jīng)丘1）和O1-2（耳線）神經(jīng)丘（：GFP brn3c）Tg的斑馬魚胚胎受精后5天（50，51）。幼蟲先用dabrafenib預(yù)處理1小時(shí)，然后再用大劑量400μM順鉑（有或沒有dabrafenib處理）進(jìn)行6小時(shí)的處理，并在淡水中恢復(fù)1小時(shí)。綠色熒光蛋白（GFP）（brn3c）和otoferlin染色用于鑒定神經(jīng)肥大HCs。在圖。與僅使用控制二甲基亞砜（DMSO）的動(dòng)物相比，僅用順鉑處理的S4幼蟲表現(xiàn)出明顯的HC損失，而與單獨(dú)使用順鉑相比，用100 nM達(dá)拉非尼共同治療的動(dòng)物具有明顯的HC損失。在所有測(cè)試濃度下單獨(dú)使用達(dá)拉非尼的治療均未顯示毒性作用。因此，達(dá)布拉非尼在體內(nèi)可預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)HC死亡。

達(dá)布拉非尼在體內(nèi)可預(yù)防順鉑引起的成年小鼠聽力損失

當(dāng)與其他MAPK抑制劑一起評(píng)估時(shí)，達(dá)布拉非尼在小鼠耳蝸外植體中顯示出更高的效價(jià)和TI，此外，先前已在臨床試驗(yàn)中對(duì)順鉑耳毒性進(jìn)行了先前檢查的化合物。因此，我們接下來在成年小鼠中測(cè)試了該藥物。我們使用強(qiáng)飼法進(jìn)行達(dá)拉非尼給藥，因?yàn)檫@種方法在臨床環(huán)境和一般人群中均易于使用。如圖4A中所述，在實(shí)驗(yàn)程序前1周建立了P42 FVB小鼠的基線聽覺腦干反應(yīng)（ABR）閾值。小鼠預(yù)處理dabrafenib（100毫克/千克），三分之一的最高報(bào)道在小鼠每日無毒劑量并且與批準(zhǔn)用于人類（每日劑量15，18，52），先前優(yōu)化順鉑之前45分鐘（30毫克/千克）腹膜內(nèi)注射（13）。然后，在順鉑暴露后24和48小時(shí)給小鼠額外的dabrafenib劑量。順鉑注射后21天使動(dòng)物恢復(fù)，并記錄最終的ABR閾值。單獨(dú)用載體或達(dá)布拉非尼治療的小鼠沒有明顯的閾值變化或體重變化。順鉑治療的動(dòng)物在8位，16和32 kHz的頻率，與先前的研究一致（已顯著升高閾移13，34）。達(dá)拉非尼和順鉑共同治療的動(dòng)物閾值漂移明顯降低，在16和32 kHz時(shí)平均降低14.9 dB。值得注意的是，dabrafenib在16 kHz（圖4B和圖 S8）。同樣，在D14時(shí)，dabrafenib和順鉑聯(lián)合治療的小鼠在16 kHz時(shí)具有各種聲刺激強(qiáng)度的ABR的波1振幅也比單獨(dú)使用順鉑的小鼠高，并且在90 dB聲壓水平（SPL）時(shí)顯著（圖4C）。

圖4 達(dá)拉非尼可預(yù)防順鉑引起的成年小鼠聽力喪失，并且不抑制順鉑殺死腫瘤的功效。

（A）將dabrafenib和順鉑給予成年P(guān)42 FVB小鼠的時(shí)間表。（B）ABR閾值遵循（A）中的協(xié)議進(jìn)行移動(dòng)。未經(jīng)處理的對(duì)照（灰色），僅順鉑（黑色），單獨(dú)達(dá)巴非尼（淺紫色）以及達(dá)布拉非尼和順鉑（深紫色）。（C）距（B）16 kHz處ABR波1的振幅。（B和C）均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，與采用Bonferroni事后檢驗(yàn)的雙向ANOVA進(jìn)行的單方順鉑比較。（D）代表性的肌球蛋白VI染色，分別來自單獨(dú)的載體，單獨(dú)的順鉑以及結(jié)合了dabrafenib（Dab）和順鉑治療的小鼠的8、16和32 kHz耳蝸區(qū)域的共聚焦圖像。（E）通過肌球蛋白VI染色計(jì)數(shù)每160μm在8、16和32 kHz耳蝸區(qū)域的OHC數(shù)；數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM，*的P <0.05，***的P <0.001，采用Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行雙向ANOVA。（F）單獨(dú)用載體，1小時(shí)順鉑處理的P42 FVB小鼠的代表性4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）（藍(lán)色），pERK（綠色）和Tuj1（紅色）免疫熒光染色的耳蝸切片30 mg / kg）或dabrafenib（100 mg / kg）進(jìn)行45分鐘的預(yù)處理，然后進(jìn)行1小時(shí)的順鉑治療。右上角鑲嵌了Corti地區(qū)器官的高倍放大圖像。n＝ 3只小鼠。（G）用達(dá)布拉非尼預(yù)處理1小時(shí)，然后聯(lián)合順鉑和達(dá)布拉非尼治療48小時(shí)，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞滴度-Glo細(xì)胞存活百分比。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM，與Bonferroni post hoc測(cè)試通過單向ANOVA進(jìn)行比較，與單用順鉑相比，* P <0.05，*** P <0.001。n = 6。

如圖4（D和E）所示，耳蝸的形態(tài)學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)用順鉑治療的動(dòng)物的OHC損失顯著，在32 kHz區(qū)域觀察到最大的損失，這與ABR閾值變化一致。在達(dá)巴非尼和順鉑聯(lián)合治療的動(dòng)物中，OHC的損失受到限制，證明了該藥的保護(hù)作用。在單獨(dú)用達(dá)拉非尼治療的小鼠中未觀察到OHC損失。最后，在順鉑腹膜內(nèi)給藥后1小時(shí)，在成年FVB小鼠的耳蝸SC中觀察到ERK磷酸化，并通過dabrafenib預(yù)處理減弱了磷酸化（圖4F）。在內(nèi)耳和支配HC的神經(jīng)纖維束中的血管紋區(qū)域也觀察到ERK磷酸化，而達(dá)拉非尼在體內(nèi)的預(yù)處理下調(diào)了磷酸化作用（圖4F）。因此，pERK免疫染色，ABR閾值測(cè)量和形態(tài)OHC計(jì)數(shù)強(qiáng)烈表明，達(dá)拉非尼的口服遞送可防止順鉑治療后耳蝸組織中的ERK磷酸化，并且對(duì)成年小鼠的順鉑引起的聽力損失具有保護(hù)作用，而僅達(dá)拉非尼治療則沒有有毒作用。

達(dá)拉非尼不干擾順鉑的殺傷功效

盡管在多種模型中證明了達(dá)拉非尼可預(yù)防耳毒性，但在考慮將其用于臨床之前，確定該藥物是否干擾順鉑的殺腫瘤功效也至關(guān)重要。在臨床環(huán)境中，順鉑用于治療多種腫瘤類型，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肺癌。因此，三種人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32，SH-SY5Y和SK-N-AS，以及三種人類肺癌細(xì)胞系：SHP-77小細(xì)胞，H1155非小細(xì)胞和A549非小細(xì)胞細(xì)胞，用于確定達(dá)拉非尼是否影響順鉑的殺腫瘤能力。單獨(dú)用達(dá)拉非尼預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，然后用15μM順鉑（對(duì)于A549為200μM）加35μM達(dá)拉非尼處理（3x保護(hù)性IC 50）在HEI-OC1細(xì)胞中孵育48小時(shí)，然后通過Cell Titer-Glo測(cè)定其活力。單獨(dú)的培養(yǎng)基，單獨(dú)的順鉑和單獨(dú)的dabrafenib處理的細(xì)胞用作對(duì)照，據(jù)報(bào)道存活率是與單獨(dú)的培養(yǎng)基相比的存活百分比（圖4E）。已發(fā)現(xiàn)達(dá)拉非尼對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡沒有抑制作用。事實(shí)上，達(dá)巴非尼在IMR-32和SHP-77細(xì)胞系中與順鉑聯(lián)用會(huì)增加腫瘤細(xì)胞死亡?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明達(dá)拉非尼不干擾順鉑的殺滅腫瘤的功效，并且在某些腫瘤中，它與順鉑協(xié)同作用可增加腫瘤細(xì)胞的死亡。

達(dá)布拉非尼可減輕成年小鼠體內(nèi)噪聲引起的聽力損失

先前的研究表明，能夠防止順鉑引起的聽力損失的化合物也可以防止噪音引起的聽力損失（13）。為了測(cè)試dabrafenib是否可以防止噪音引起的聽力損失，我們使用了先前發(fā)布的協(xié)議，其中在建立基線ABR和DPOAE閾值后5至7天，小鼠在8至16 kHz的頻率下暴露于100 dB的噪音八度頻段持續(xù)2小時(shí)，這導(dǎo)致噪聲暴露后14天觀察到的永久性ABR和DPOAE閾值偏移30到50 dB（13）。在噪聲侵害前45分鐘，通過口服強(qiáng)飼法給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)拉非尼（100 mg / kg），并在噪聲暴露后24和48小時(shí)再給予兩次劑量（圖5A））。與單獨(dú)使用載體相比，用達(dá)拉非尼治療的動(dòng)物的ABR閾值偏移明顯更低，在三個(gè)測(cè)試頻率下的平均保護(hù)為16.8 dB（圖5B和圖S8）。達(dá)巴非尼治療的未暴露噪音的小鼠未表現(xiàn)出明顯的閾值漂移，體重變化或一般行為。另外，盡管噪聲降低了16kHz ABR波1的幅度，但達(dá)布拉非尼在80dB和90dB SPL時(shí)顯著減輕了這種影響（圖5C）。在一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)中，遭受噪聲暴露的小鼠在8 kHz和16 kHz時(shí)DPOAE閾值偏移急劇增加，而達(dá)布拉非尼治療則提供了顯著的保護(hù)作用（圖5D）。

圖5 達(dá)拉非尼預(yù)處理可防止成年小鼠因噪音引起的聽力損失。

（A）對(duì)成人P42 FVB小鼠施用達(dá)拉非尼的時(shí)間表和噪聲暴露。（B）ABR閾值遵循（A）中的協(xié)議進(jìn)行移動(dòng)。達(dá)巴非尼無噪音暴露治療（淺紫色），無噪音（黑色）和達(dá)巴非尼無噪音治療（深紫色）。（C）距（B）16 kHz處ABR波1的振幅。（D）DPOAE閾值遵循（A）中的協(xié)議。攜帶者不接觸噪音（灰色），達(dá)布拉非尼治療不接觸噪音（淺紫色），單獨(dú)噪聲（黑色）和達(dá)布拉非尼治療不接觸噪音（深紫色）。（B至D）均值±SEM，* P<0.05，** P <0.01，*** P與采用Bonferroni事后檢驗(yàn)的雙向方差分析相比，單獨(dú)噪聲<0.001。（E）在整個(gè)安裝的小鼠耳蝸中，在16 kHz區(qū)域，代表性的Ctbp2點(diǎn)狀（紅色）和肌球蛋白VI（綠色）染色的IHC共聚焦圖像。（F）計(jì)數(shù)每個(gè)IHC在16 kHz耳蝸區(qū)域的Ctbp2點(diǎn)數(shù)；數(shù)據(jù)顯示為均值±SEM，* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，采用Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行單向ANOVA。n = 4耳蝸。（G）代表性的鬼筆環(huán)肽（紅色）和pERK（綠色）免疫熒光染色的成年FVB小鼠耳蝸。按照來自（A）的方案，將小鼠暴露于噪音中，然后安樂死，并在噪音暴露后3小時(shí)進(jìn)行耳蝸固定。下面的正交部分顯示了用白色箭頭標(biāo)識(shí)的OHC，用黃色箭頭標(biāo)識(shí)的IHC，以及用標(biāo)記箭頭標(biāo)識(shí)的pERK陽性DC和IPhC。n = 2耳蝸。

收集這些動(dòng)物的耳蝸，并對(duì)肌球蛋白VI染色以進(jìn)行形態(tài)分析。盡管沒有觀察到顯著OHC損失，以前的研究報(bào)告中的突觸色帶其中內(nèi)的HC（IHCS）形成與神經(jīng)元纖維（突觸聯(lián)系的功能障礙噪聲損傷導(dǎo)致53，54）。為此，對(duì)耳蝸進(jìn)行染色以檢測(cè)突觸帶狀支架蛋白Ctbp2，以測(cè)量IHC在16 kHz區(qū)域的突觸帶完整性的喪失（圖5，E和F）。與僅用達(dá)布拉非尼治療且無噪聲暴露的對(duì)照小鼠相比，僅接觸噪聲的單獨(dú)攜帶者的小鼠每IHC的Ctbp2-點(diǎn)數(shù)明顯減少。達(dá)拉非尼治療可部分挽救小鼠的點(diǎn)狀損失，其結(jié)果與16 kHz時(shí)ABR閾值偏移相關(guān)。此外，我們?cè)噲D確定噪聲刺激是否會(huì)引起耳蝸中ERK的磷酸化，這與順鉑損傷時(shí)觀察到的相似。在對(duì)鬼筆環(huán)肽和pERK進(jìn)行噪聲暴露后立即和在3小時(shí)后對(duì)小鼠耳蝸進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，噪聲激活了SC（特別是DC和IPhC）中的ERK（圖5G和圖S5），與順鉑處理過的耳蝸的圖像非常相似（圖3， C和D以及4F）。達(dá)拉非尼預(yù)處理可減少這些SC中的ERK磷酸化（圖5G）。因此，結(jié)合的ABR閾值移位數(shù)據(jù)和Ctbp2-puncta測(cè)量結(jié)果表明，dabrafenib預(yù)處理可對(duì)體內(nèi)成年小鼠的噪聲誘導(dǎo)的耳毒性提供明顯的保護(hù)，并阻斷MAPK途徑的噪聲激活。

dabrafenib和AZD5438的聯(lián)合治療可防止成年小鼠體內(nèi)噪聲暴露后的聽力損失

噪聲損傷并非總是可以預(yù)測(cè)的，因此預(yù)處理通常不是一種選擇。因此，我們?cè)噲D確定達(dá)布拉非尼在噪聲暴露后給藥時(shí)是否具有保護(hù)作用。為此，我們修改了之前的噪音實(shí)驗(yàn)規(guī)程（圖5A），改為在噪音侵害后24、48和72小時(shí)給小鼠dabrafenib治療（圖6A）。同樣，為了提高治療效果，我們沒有給小鼠每天100 mg / kg的一劑藥物，而是每天兩次兩次，兩次治療之間8小時(shí)通過口服強(qiáng)飼法給予達(dá)拉非尼，因?yàn)樵摶衔镉幸话胙h(huán)壽命大約8小時(shí)（55）。在該方案中使用達(dá)布拉非尼治療可顯著降低閾值漂移，在16 kHz頻率下平均降低21.0 dB（圖6B）。因此，數(shù)據(jù)表明達(dá)拉非尼在體內(nèi)成年小鼠體內(nèi)暴露于噪音后，可提供保護(hù)，防止噪音引起的聽力損失。

圖6 Dabrafenib和AZD5438后處理可防止成年小鼠受到噪音介導(dǎo)的聽力損失。

（A）向成年P(guān)42 FVB小鼠施用化合物和噪聲的時(shí)間表。（B）對(duì)照組和達(dá)布拉非尼（60 kg / mg）每日兩次經(jīng)口管飼的小鼠在100-dB 8至16-kHz八度頻帶噪聲2小時(shí)后14天記錄ABR閾值變化。達(dá)巴非尼無噪音暴露治療（淺紫色），無噪音（黑色）和達(dá)巴非尼無噪音治療（深紫色）。平均值±SEM，** P<0.01，與采用Bonferroni post hoc測(cè)試的雙向ANOVA進(jìn)行的單獨(dú)噪聲比較。（C）對(duì)照組和每日兩次經(jīng)口管飼的AZD5438（35 kg / mg）每天兩次的小鼠在100-dB 8至16-kHz八度頻帶噪聲2小時(shí)后14天記錄ABR閾值變化。AZD5438不帶噪聲暴露的治療（淺綠色），僅帶噪聲的治療（黑色）和達(dá)布拉非尼帶噪聲暴露的治療（深綠色）。與采用Bonferroni事后檢驗(yàn)的雙向方差分析相比，該值與單獨(dú)的噪聲相比并不顯著。（D）對(duì)照和通過每天兩次口服治療的dabrafenib（60 kg / mg）和AZD5438（35 mg / kg）聯(lián)合治療的小鼠經(jīng)100-dB 8至16kHz倍頻程噪聲2小時(shí)后14天記錄ABR閾值變化管。達(dá)巴非尼和AZD5438治療無噪音暴露（淺紅色），僅噪音（黑），達(dá)布拉非尼和AZD5438治療（深紅色）。平均值±SEM，*** P 與采用Bonferroni事后檢驗(yàn)的雙向方差分析相比，單獨(dú)噪聲<0.001。

最近，我們確定了防止順鉑和噪音引起的聽力損失（幾個(gè)CDK2抑制劑13，34）。AZD5438是可口服生物利用的第二代CDK2抑制劑。因此，我們?cè)噲D確定該化合物是否可以與達(dá)拉非尼聯(lián)合使用，以增強(qiáng)抵抗順鉑和噪音引起的聽力損失的保護(hù)作用（圖S6A）。最初，我們?cè)陧樸K暴露的人工耳蝸外植體模型中測(cè)試了30 nM達(dá)拉非尼和0.34 nM AZD5438的組合，表明與單獨(dú)使用每種藥物相比，它提供了增強(qiáng)的保護(hù)作用（圖S6B）。為了確保AZD5438和dabrafenib / AZD5438的聯(lián)合治療不會(huì)干擾順鉑的殺傷功效，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肺癌細(xì)胞株進(jìn)行了測(cè)試（圖S6C）。除了僅用于AZD5438的SKN-AS細(xì)胞系外，在所有測(cè)試的細(xì)胞系中，單獨(dú)的AZD5438以及達(dá)拉非尼和AZD4538的聯(lián)合治療均不會(huì)干擾或增強(qiáng)順鉑介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡。此外，使用經(jīng)口管飼法遞送的單劑量AZD5438（75 mg / kg）進(jìn)行的小鼠預(yù)處理實(shí)驗(yàn)表明，AZD5438可以防止順鉑和噪音引起的聽力損失（圖S7，A至D）。但是，重復(fù)噪聲后治療實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口管飼法每天兩次遞送的AZD5438（35 mg / kg）并未顯著降低小鼠的ABR閾值變化（圖6C）。

最后，我們?cè)噲D確定達(dá)拉非尼和AZD5438的組合能否在噪聲暴露后提供增強(qiáng)的保護(hù)。與單獨(dú)攜帶者的小鼠相比，在噪聲暴露后每天24、48和72小時(shí)每天兩次用dabrafenib（60 mg / kg）和AZD5438（35 mg / kg）處理的小鼠表現(xiàn)出明顯降低的ABR閾值變化，平均降低24.4 8、16和32 kHz頻率下的dB。沒有噪聲暴露的對(duì)照達(dá)布拉非尼和AZD5438治療的小鼠未表現(xiàn)出明顯的閾值變化或體重/行為改變?？傮w而言，在所有測(cè)試頻率下，與單獨(dú)使用每種化合物相比，該治療方案均可提供增強(qiáng)的，幾乎完全的保護(hù)（圖6D）。

討論

在美國，噪聲誘發(fā)的聽力損失是第二大最常見的感覺神經(jīng)性聽力障礙形式，僅次于與年齡相關(guān)的聽力損失（老年性耳聾）（56）。順鉑誘導(dǎo)的聽力損失是化療的患者40?60％的不可避免的副作用與來自不同程度的聽力損失（癌癥患8，57）。鑒定在化療期間和暴露于噪音后可以給予患者的藥物，以保護(hù)和預(yù)防聽力損失是迫切的醫(yī)療需求。

達(dá)拉非尼可預(yù)防順鉑和噪音損害

達(dá)夫拉非尼是一種BRAF特異性抑制劑，在我們的細(xì)胞系篩選中對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡表現(xiàn)最出色，并且在耳蝸外植體培養(yǎng)物中顯示出離體保護(hù)，并且在斑馬魚側(cè)線神經(jīng)質(zhì)和順鉑小鼠模型中顯示出顯著的體內(nèi)保護(hù)作用。和噪音引起的聽力損失。在這項(xiàng)研究中，我們使用了一次大劑量順鉑方案（30 mg / kg）作為小鼠中的原理證明，來測(cè)試dabrafenib對(duì)順鉑的保護(hù)作用。我們手中的這種一劑順鉑方案與低劑量的多藥順鉑方案有很好的相關(guān)性（58），正如我們先前針對(duì)肯帕龍比較兩種方案所顯示的那樣（13））。我們?cè)诳赡軐?dǎo)致FVB小鼠永久性聽力喪失，100 dB SPL八度頻段持續(xù)2小時(shí)的條件下測(cè)試了達(dá)布拉非尼的噪聲防護(hù)，并且處于人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷脑肼晸p害范圍之內(nèi)。結(jié)合達(dá)布拉非尼在人類使用中的大量信息，我們的結(jié)果表明，它可以迅速用于人類的聽力保護(hù)和治療。

正如我們預(yù)期的那樣，達(dá)布拉非尼穿過血迷宮屏障，通過口服給藥對(duì)小鼠產(chǎn)生了觀察到的作用。dabrafenib的這樣的性質(zhì)目前區(qū)別于許多其他候選人在臨床試驗(yàn)中用于otoprotection（1，2，59）和進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)活性研究將提供深入了解藥物性質(zhì)優(yōu)選用于通過血-迷路屏障（60）。

達(dá)拉非尼不干擾順鉑殺死腫瘤細(xì)胞的功效

在這項(xiàng)研究中，我們測(cè)試了達(dá)拉非尼在兩種代表性腫瘤類型中對(duì)順鉑殺傷功效的干擾，其中兩種標(biāo)準(zhǔn)治療均以順鉑作為一部分：小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成年肺癌。我們發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤的代表性遺傳細(xì)胞系中，達(dá)布拉非尼不會(huì)干擾，在兩種細(xì)胞系中，IMR-32和SHP-77甚至可以在防止小鼠聽力損失的劑量下增強(qiáng)順鉑殺死腫瘤的功效。達(dá)拉非尼已被公認(rèn)是一種有效的抗肺癌藥物（18），并且如預(yù)期的那樣，本研究中僅藥物治療就抑制了肺癌細(xì)胞的存活，并顯著抑制了SHP-77細(xì)胞，并且在H115和A549中觀察到了類似的趨勢(shì)細(xì)胞（圖4G）。AZD5438與順鉑共同處理不會(huì)干擾所測(cè)試的六個(gè)細(xì)胞系中五個(gè)細(xì)胞的順鉑殺傷功效，甚至可以顯著增強(qiáng)對(duì)三個(gè)腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用（圖S6C）。在成神經(jīng)細(xì)胞瘤SKN-AS細(xì)胞系中，AZD5438干擾了順鉑的殺傷能力，盡管與達(dá)布拉非尼聯(lián)合使用時(shí)未測(cè)到干擾（圖S6C）。根據(jù)達(dá)布拉非尼的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)噪聲耳毒性的保護(hù)作用，我們的證據(jù)表明它不直接干擾順鉑，而是通過BRAF細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)起作用。達(dá)拉非尼的這種特性使其在目前的臨床試驗(yàn)中具有優(yōu)異的抗順鉑耳毒性保護(hù)作用，優(yōu)于其他許多候選治療藥物。

達(dá)拉非尼在FDA批準(zhǔn)的人類使用濃度下可防止順鉑和噪音引起的聽力損失

在小鼠中觀察到的保護(hù)劑量與批準(zhǔn)用于人類的劑量相同。我們未觀察到達(dá)拉非尼單獨(dú)治療3天的體重，一般外觀/行為和長達(dá)21天的耳毒性對(duì)小鼠的全身毒性或耳毒性作用（圖4和5））。達(dá)拉非尼長期以每天6到12個(gè)月的劑量（相當(dāng)于小鼠的等效劑量）對(duì)人體給藥時(shí)，會(huì)產(chǎn)生諸如發(fā)燒，關(guān)節(jié)痛，皮疹和乳頭狀瘤的副作用。因此，重要的是進(jìn)一步確定人在短期內(nèi)使用達(dá)布拉非尼的副作用，以及確定體內(nèi)TI的小鼠最低有效劑量。此外，修改給藥方案和配方將進(jìn)一步提高達(dá)布拉非尼在臨床上作為耳保護(hù)劑的臨床潛力。正如我們?cè)诖颂幾C明的針對(duì)噪音引起的聽力損失的達(dá)拉非尼/ AZD5438的聯(lián)合治療，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，即允許使用每種劑量的較低劑量的藥物，這些藥物可減少不良副作用，而不會(huì)損害保護(hù)或治療效果。

達(dá)拉非尼抑制SC中ERK激酶的磷酸化

達(dá)布拉非尼抑制一種新的耳蝸靶BRAF激酶及其相關(guān)的下游激酶MEK1 / 2和ERK1 / 2，以保護(hù)其免受順鉑和噪音誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明它們?cè)谟薪z分裂后的耳蝸細(xì)胞中具有關(guān)鍵的促凋亡作用。我們觀察到短時(shí)間內(nèi)順鉑和耳蝸SC（尤其是DC和IPhC）中的順鉑和噪音損害均導(dǎo)致磷酸化ERK上調(diào)。這兩種BRAF / MEK / ERK途徑在重疊細(xì)胞中的損傷均上調(diào)，這不僅解釋了為何同一藥物可以保護(hù)免受兩種來源的損害，而且進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的篩選方法能夠識(shí)別出可防止兩種損傷的藥物。由于生長遲緩以及血管和神經(jīng)元缺陷Wojnowski，小鼠BRAF的生殖系敲除導(dǎo)致E10.5至12.5之間的胚胎死亡等。（61）。生成其中BRAF在內(nèi)耳細(xì)胞和/或耳蝸SC中特異缺失的小鼠模型，將進(jìn)一步評(píng)估BRAF在有絲分裂后的耳蝸細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用的機(jī)制。

近年來的一些研究表明，SCs在觸發(fā)和傳遞耳蝸中的細(xì)胞死亡信號(hào)中起著重要作用。Lahne和Gale表明，在耳蝸外植體受到機(jī)械損傷或氨基糖苷新霉素的幾分鐘之內(nèi)，胞漿中的磷酸化ERK在Deiters和指骨細(xì)胞中被瞬時(shí)激活，而在HCs中則未被激活（26）。前田等。（27）和Herranen等。（28）表明在2小時(shí)的120或105 dB倍頻程噪聲后，支持性耳蝸細(xì)胞中的核磷酸ERK信號(hào)被瞬時(shí)激活。我們的數(shù)據(jù)與以前的出版物相結(jié)合，表明在各種損傷（例如順鉑，噪音，氨基糖苷或機(jī)械損傷）后，細(xì)胞質(zhì)中會(huì)立即激活pERK，并且pERK會(huì)在數(shù)小時(shí)后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。已知ERK蛋白可穿梭至細(xì)胞核以發(fā)揮其活性（62）。此外，在成年的耳蝸中，我們觀察到順鉑給藥后1小時(shí)，達(dá)拉非尼下調(diào)的血管紋狀體和神經(jīng)纖維束支配HC的區(qū)域出現(xiàn)pERK染色（圖4F）。以前的報(bào)告已經(jīng)記錄到紋和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的順鉑誘導(dǎo)的損傷，增強(qiáng)這些細(xì)胞以順鉑處理（敏感63 - 66）。

我們的結(jié)果表明，細(xì)胞中pERK激活的下游目標(biāo)可以調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子，從而增加分泌配體作為HCs向周圍細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，從而影響其存活。從死亡途徑前庭旺抗生素侮辱后分泌的熱休克蛋白HSP70的保護(hù)作用已經(jīng)被報(bào)道（67，68）。ERK激酶上調(diào)了幾個(gè)有絲分裂后細(xì)胞系統(tǒng)中應(yīng)激反應(yīng)途徑中涉及的熱激蛋白（69）。此外，ERK磷酸化可以觸發(fā)在耳蝸的免疫應(yīng)答，并可能有助于活化巨噬細(xì)胞募集到受損區(qū)域（28，70）。因此，我們的研究表明，BRAF / MEK / ERK和CDK2途徑是HSP70和巨噬細(xì)胞募集的上游調(diào)節(jié)劑，以介導(dǎo)其在有絲分裂后細(xì)胞中的應(yīng)激活化作用。

抑制BRAF在有絲分裂后細(xì)胞中的保護(hù)機(jī)制

當(dāng)在腫瘤細(xì)胞中激活時(shí)，BRAF / MEK / ERK途徑通常與細(xì)胞增殖和存活有關(guān)。相反，在耳蝸有絲分裂后細(xì)胞中，達(dá)布拉非尼對(duì)BRAF途徑的抑制作用可減少細(xì)胞死亡并提高細(xì)胞存活率，如此處所示。CDK2抑制劑，我們?cè)陬愃破聊幌惹拌b定也顯示在有絲分裂后細(xì)胞耳蝸保護(hù)而這兩個(gè)BRAF抑制劑和CDK2抑制劑在腫瘤細(xì)胞（抗增殖化合物的兩種已知的基團(tuán)13，34）。對(duì)于ARAF（RAF-1），BRAF的家庭成員，在保護(hù)免受凋亡刺激細(xì)胞角色已在內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞有絲分裂后細(xì)胞前所示，盡管這些通路是獨(dú)立的MEK激酶（71，72）。因此，我們建議BRAF / MEK / ERK和CDK2在有絲分裂后細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡作用，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促增殖作用。這些途徑如何在上游應(yīng)激時(shí)被激活，以及它們的藥理抑制作用如何減輕有絲分裂后細(xì)胞下游的凋亡，還有待探索。在有或沒有順鉑或噪聲暴露的情況下，可以使用體內(nèi)藥物遺傳學(xué)干預(yù)措施進(jìn)一步分析BRAF / MEK / ERK和CDK2之間的上位性及其途徑。

口服達(dá)拉非尼和AZD5438的治療潛力

總之，我們的研究提供了將達(dá)布拉非尼重新用作候選藥物來預(yù)防順鉑和噪聲引起的聽力損失的關(guān)鍵結(jié)果。dabrafenib與AZD5438的組合即使在暴露于噪音下24小時(shí)后仍可提供全面保護(hù)。我們的結(jié)果的基礎(chǔ)上，dabrafenib也可為在內(nèi)耳（抗生素誘發(fā)的和年齡相關(guān)性聽力損失測(cè)試2，6，59，73，74）。我們的研究有望導(dǎo)致首批經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的專門用于聽力保護(hù)的藥物（75）。我們還提供證據(jù)表明，BRAF / MEK / ERK和CDK2途徑雖然在腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，但在有絲分裂后的耳蝸細(xì)胞中發(fā)揮促凋亡和應(yīng)激激活的作用，這是有絲分裂后細(xì)胞中這些途徑的不足的特征。結(jié)果，達(dá)拉非尼也可能用于治療患有腎臟和大腦有絲分裂后細(xì)胞的退行性疾病。在治療帕金森氏病的硅藥物篩查中，達(dá)拉非尼最近獲得了最高評(píng)價(jià)（76）。

材料和方法

倫理聲明

所有動(dòng)物程序均已由Creighton大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)和Boys Town國家研究醫(yī)院批準(zhǔn)。

鼠標(biāo)型號(hào)

FVB繁殖小鼠購自杰克遜實(shí)驗(yàn)室（Jackson Laboratory），在Creighton University動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng)，用于噪聲破壞和順鉑治療實(shí)驗(yàn)。通過腹膜內(nèi)注射Avertin（500 mg / kg）（2,2,2-三溴乙醇，T4，840-2; Sigma-Aldrich）麻醉動(dòng)物，并通過腳趾夾捏確定完全麻醉。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，將麻醉過的動(dòng)物放在加熱墊上以保持體溫，直到醒來。

斑馬魚模型

斑馬魚（Danio rerio）品系Tg（brn3c：GFP）是通過成年魚成對(duì)交配而獲得的，這些成年魚是由機(jī)構(gòu)動(dòng)物保育和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，在成男孩鎮(zhèn)國家研究醫(yī)院飼養(yǎng)的。

細(xì)胞系

分別發(fā)現(xiàn)了三種人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32，SH-SY5Y和SK-N-AS，以及三種人類肺癌細(xì)胞系SHP-77小細(xì)胞，H1155非小細(xì)胞和A549非小細(xì)胞。用于確定化合物對(duì)順鉑殺傷腫瘤的作用（77 – 83）。細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），并根據(jù)ATCC規(guī)范進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32和SH-SY5Y維持在Dulbecco改良的Eagle's培養(yǎng)基（DMEM）中，葡萄糖（4.5 g /升）1X-谷氨酰胺和丙酮酸鈉（10-013-CV，康寧）加入10％胎牛血清（FBS）（35011132，康寧）和氨芐西林（50μg/ ml; A5354-10ML，Sigma-Aldrich）。將SK-N-AS細(xì)胞系維持在DMEM 1x中，含D-葡萄糖（4.5 g /升），L-谷氨酰胺和25 mM Hepes（12430-054，Gibco），含10％FBS和0.1 mM非必需氨基酸，并加入氨芐西林（50μg/ ml）。將A549細(xì)胞維持在添加有10％FBS和氨芐青霉素（50μg/ ml）的1-谷氨酰胺（30-2004，ATCC）的F-12K培養(yǎng)基中。將SHP-77和H1155細(xì)胞系保存在RPMI 1640（30-2020，ATCC）中，添加5％FBS和氨芐西林（50μg/ ml）。所有腫瘤細(xì)胞系均在37°C和5％CO 2下生長并使用0.05％胰蛋白酶-EDTA 1×（25300-054，Gibco）傳代。HEI-OC1細(xì)胞系（12 – 14）保持在DMEM 1x中，葡萄糖（4.5 g /升），1-谷氨酰胺和丙酮酸鈉（12430-054，Gibco）含10％FBS，氨芐西林（50μg/毫升），然后加入250微升γ-干擾素。這些細(xì)胞在允許的溫度33°C和10％CO 2下培養(yǎng)，并使用0.05％胰蛋白酶-EDTA 1x傳代。對(duì)于HEI-OC1細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)步驟前24小時(shí)，應(yīng)從培養(yǎng)基中去除γ-干擾素以限制細(xì)胞生長。

基于細(xì)胞的caspase-3 / 7活性和Cell Titer-Glo活力HTS可防止順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

在這些篩選中，選擇caspase-3裂解作為指示順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的終點(diǎn)，因?yàn)樗试S在HEI-OC1細(xì)胞中caspase-3裂解上游的任何分子靶標(biāo)水平監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡的抑制作用線。將細(xì)胞以事先優(yōu)化的每孔1600個(gè)細(xì)胞的濃度接種在不含γ干擾素的培養(yǎng)基中，以限制增殖，并根據(jù)先前的劑量反應(yīng)曲線針對(duì)50μM順鉑進(jìn)行測(cè)試。將被測(cè)化合物溶解在DMSO中，然后添加到最終DMSO濃度<0.5％的培養(yǎng)基中。屏幕是以細(xì)節(jié)在我們以前的出版物（描述12，13）。Pifithrin-α被選定為所述屏幕的參照化合物，因?yàn)樗ㄟ^抑制胱天蛋白酶3切割與IC提供針對(duì)順鉑耳毒性的良好保護(hù)50 7.7μM（圖S1）的（5，12，84）。將Pifithrin-α添加到每個(gè)平板中作為篩選質(zhì)量控制。驗(yàn)證了Caspase-Glo 3/7（Promega）測(cè)定法的線性度，該測(cè)定法能夠測(cè)量因caspase-3 / 7裂解而發(fā)出的光并且適用于HTS，并且已驗(yàn)證0.5％DMSO具有對(duì)細(xì)胞死亡動(dòng)力學(xué)沒有影響。以1nM至85μM的最終濃度一式三份篩選化合物，并孵育22小時(shí)。Caspase-Glo 3/7分析定義了100％caspase-3 / 7活性，因?yàn)閱为?dú)用順鉑處理的細(xì)胞和單獨(dú)用培養(yǎng)基處理的細(xì)胞分配了0％caspase-3 / 7活性。命中定義為在50μM順鉑存在下可使caspase-3 / 7活性降低50％或更多的化合物?；衔锏亩拘酝ㄟ^單獨(dú)的化合物單獨(dú)的可行性測(cè)定Cell Titer-Glo（Promega）進(jìn)行了測(cè)試（12）。蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集激酶篩選在已沉積抑制劑https://data.mendeley.com/datasets/yz9rbxyksf/1，DOI：10.17632 / yz9rbxyksf.1。

腫瘤細(xì)胞滴度-Glo活力測(cè)定

首先將細(xì)胞鋪在96孔板中，然后在37°C的5％CO 2中附著過夜。第二天，癌細(xì)胞僅用化合物預(yù)處理1小時(shí)，然后用15μM順鉑（對(duì)于A549為200μM）加上化合物處理48小時(shí)，然后通過Cell Titer-Glo（Promega）進(jìn)行分析以測(cè)量生存力。單獨(dú)培養(yǎng)基，單獨(dú)順鉑和單獨(dú)藥物處理的細(xì)胞用作對(duì)照，據(jù)報(bào)道存活率是與單獨(dú)培養(yǎng)基相比的存活百分比。使用了達(dá)布拉非尼（35μM）和AZD5438（2.1μM），是caspase-3 / 7 HTS中針對(duì)順鉑的保護(hù)性IC 50的三倍。

耳蝸外植體

將P3-P4 FVB小鼠耳蝸解剖并在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)皿中保持過濾，該培養(yǎng)皿上裝有1 ml生長培養(yǎng)基DMEM（12430-054，Gibco Life Technologies）和1％FBS（16000-044，Gibco Life Technologies） ，B-27補(bǔ)充劑（200μl/ 500 ml; 17504-44，Gibco Life Technologies），N-2補(bǔ)充劑（100μl/ 500 ml; 17502-048，Gibco Life Technologies）和氨芐青霉素（50μg/ ml; A5354過濾器（Millicell，PICM03050，Millipore）內(nèi)外的-10ML，Sigma-Aldrich。人工耳蝸外植體培養(yǎng)1天后，添加有或沒有測(cè)試化合物的生長培養(yǎng)基，在37°C的5％CO 2中孵育1小時(shí)。，然后與150μM順鉑（479306，Sigma-Aldrich）在有或沒有受試化合物的情況下在生長培養(yǎng)基中于37°C孵育24小時(shí)。根據(jù)50、100、150和200μM順鉑的劑量反應(yīng)選擇150μM的順鉑濃度，并且由于外植體試驗(yàn)一致顯示，在此濃度下，小鼠耳蝸中約40％的OHC在24小時(shí)后死亡小時(shí)（圖1D和2，B至H）。用4％多聚甲醛固定耳蝸，并用Alexa Fluor 568鬼筆環(huán)肽對(duì)F-肌動(dòng)蛋白染色以確定HCs的活力。通過共聚焦顯微鏡對(duì)耳蝸進(jìn)行成像，拍攝來自中間彎道的兩個(gè)160μm區(qū)域，并計(jì)算完整HC的數(shù)量。對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)試了2至5個(gè)獨(dú)立的耳蝸。注意，IC 50 dabrafenib在體外外植體培養(yǎng)是400倍更好比IC 50在內(nèi)部細(xì)胞系測(cè)量并且可以歸因于所存在僅在耳蝸外植體培養(yǎng)的細(xì)胞特異性受體的藥物。這不是達(dá)拉非尼所獨(dú)有的，在本研究和我們以前的研究中，所有熱門藥物都觀察到了這一點(diǎn)（圖2和表S1）（13）。

斑馬魚側(cè)線

斑馬魚（D. rerio）的任何性別的實(shí)驗(yàn)幼蟲都是通過在Boys Town國家研究醫(yī)院飼養(yǎng)的成年魚配對(duì)交配而獲得的。我們使用了斑馬魚系Tg（brn3c：GFP）在HCs中表達(dá)膜結(jié)合的GFP。將魚維持在28.5°C的E3培養(yǎng)基中[5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl 2和0.33 MgSO 4（pH 7.2）]，密度為每100 mm 2培養(yǎng)皿50個(gè)胚胎/幼體。在受精后5天使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并在治療后和固定前冷凍麻醉。我們的研究中的平均HC計(jì)數(shù)是從以下三個(gè)神經(jīng)質(zhì)獲得的：MI1（中樞神經(jīng)母細(xì)胞1）和O1和O2（麻痹線）。

小鼠順鉑治療

將十毫克的順鉑（479306，Sigma-Aldrich）粉末在37°C的10 ml無菌鹽水（0.9％NaCl）中溶解40至60分鐘。通過腹膜內(nèi)注射以30 mg / kg的順鉑向FVB小鼠給藥。順鉑注射前一天，小鼠通過皮下注射接受1 ml生理鹽水。為了改善順鉑注射后的脫水，每天兩次注射1 ml溫鹽水，至少7天，或者直到體重開始恢復(fù)為止。將經(jīng)順鉑治療的小鼠的籠子放在加熱墊上至少7天，或直到體重開始恢復(fù)。每天至少提供7天新鮮糊狀食物。順鉑和順鉑聯(lián)合達(dá)拉非尼治療均觀察到50％的存活率。

通過管飼法給予化合物

化合物甲磺酸達(dá)拉非尼（HY-14660A）和AZD5438（HY-10012）購自MedChemExpress，并通過管飼法施用于FVB小鼠。將化合物溶解在10％DMSO，5％Tween 80（P1754，Sigma-Aldrich），40％PEG-E-300（91462-1KG，Sigma-Aldrich）和45％0.9％鹽水的混合物中。對(duì)于順鉑和噪音預(yù)處理方案，在耳毒性損傷之前45分鐘，對(duì)小鼠進(jìn)行dabrafenib（100 mg / kg）和AZD5438（75 mg / kg）的初始治療，并在損傷后24和48小時(shí)進(jìn)行后續(xù)治療。對(duì)于噪音后處理方案，化合物治療分別在噪音損害后的24、48和72小時(shí)間隔內(nèi)，分別在8天內(nèi)分別以dabrafenib（60 mg / kg）和AZD5438（35 mg / kg）進(jìn)行兩次治療。

ABR閾值和Wave 1幅度測(cè)量

ABR在小鼠中對(duì)于左耳測(cè)定稍作修改（先前所描述的13，34）。簡而言之，通過使用位于顱骨，耳廓下方和尾巴底部的皮下針，在一個(gè)聲音室（工業(yè)聲學(xué)公司）中記錄ABR波形，并將響應(yīng)輸入到低阻抗Medusa數(shù)字生物中放大器系統(tǒng)（RA4L; TDT; 20 dB增益）。在每個(gè)頻率處，當(dāng)電響應(yīng)剛好在本底噪聲之上時(shí)，以10 dB的步長將刺激強(qiáng)度從90 dB降低至0 dB，以確定閾值分貝SPL。ABR波形是對(duì)500個(gè)音頻突發(fā)響應(yīng)的平均值。記錄的信號(hào)由300 Hz至3 kHz的帶通濾波器濾波。在所有治療前1周采集成年FVB小鼠（6周齡）的治療前ABR記錄，并在順鉑治療后21天或噪聲暴露后14天記錄治療后ABR的測(cè)量值。ABR閾值由五個(gè)波形峰中的三個(gè)或三個(gè)以上的任何一個(gè)確定。在所有測(cè)試頻率下，用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的基本ABR閾值在10至40 dB之間。所有閾值和位移均由兩名實(shí)驗(yàn)者分別為每只小鼠確定。測(cè)量各個(gè)ABR波1的振幅，作為正峰值與隨后的負(fù)谷之間的差。

老鼠的噪音暴露

將小鼠放在定制的丙烯酸室中的各個(gè)籠子中。聲音刺激是由System RZ6（TDT）設(shè)備產(chǎn)生的，并使用75A功率放大器（Crown）進(jìn)行了放大。聲音通過揚(yáng)聲器喇叭（JBL）傳遞到丙烯酸室。SPL使用1/4英寸自由場麥克風(fēng)（PCB）進(jìn)行了校準(zhǔn)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性噪聲暴露之前，使用1/4英寸麥克風(fēng)對(duì)腔室內(nèi)籠的四個(gè)象限進(jìn)行采樣，以確保在測(cè)量位置上，SPL的變化<0.5 dB。然后將成年小鼠暴露于100 dB的2小時(shí)八度音帶噪聲（8至16 kHz）。

組織制備和免疫熒光

從成年小鼠耳蝸制備和檢查如（先前所描述的85，86）。所有圖像均用共聚焦顯微鏡（LSM 700或710，Zeiss）采集。樣品用鬼筆環(huán)肽（A12379或A12380，Invitrogen）或其他標(biāo)記的抗體染色。使用了以下一級(jí)抗體：抗肌球蛋白VI（1：400； 25-6791； Proteus Bioscience），抗肌球蛋白VIIa（5μg/μl； 138-1-s，發(fā)育研究雜交瘤銀行），抗Tuj1（ 1：250； 801201，BioLegend），抗pERK（1：400； 9101S，細(xì)胞信號(hào)技術(shù)）或抗Ctbp2（1：500； 612044，BD轉(zhuǎn)導(dǎo)）?？雇肁lexa Fluor 488（1：400; A11034）和抗小鼠Alexa Fluor 647（1：400; A31571）二抗購自Invitrogen。使用具有4'，6-diamidino-2-phenylindole（P36941，Invitrogen）的ProLong金抗褪色劑對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。

Ctbp2染色和定量

Corti器官被抗Ctbp2和抗肌球蛋白VI抗體染色。使用具有63倍物鏡的Zeiss 700掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行共聚焦成像。使用ZEN 2009或ZEN 2012軟件（Zeiss）進(jìn)行可視化和投影。使用以前報(bào)告的ZEN 2009或ZEN 2012三維構(gòu)造函數(shù)，對(duì)重建后的三維圖像上的Ctbp2點(diǎn)進(jìn)行可視化和計(jì)數(shù)（54）。從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選擇了兩只無噪聲的達(dá)布拉非尼單獨(dú)治療的FVB小鼠的耳蝸，以及四只受到噪聲的載體和四只經(jīng)達(dá)布拉非尼治療的FVB小鼠的耳蝸，從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選擇，用于量化Ctbp2點(diǎn)。在16 kHz耳蝸區(qū)域附近采集圖像，每個(gè)圖像包括12到18個(gè)IHC，量化為Ctbp2點(diǎn)的總數(shù)除以每個(gè)圖像的IHC總數(shù)。

免疫印跡

加入蛋白酶（cOmplete ULTRA Tablets 05892791001）和磷酸酶（PhosSTOP 04906845001）抑制劑（Roche）后，在裂解緩沖液（9803，Cell Signaling Technology）中制備HEI-OC1細(xì)胞的完整裂解物。將裂解物在4°C下以15,000 g離心10分鐘，并收集上清液。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（23235，Thermo Fisher Scientific）確定蛋白溶液中的蛋白濃度。將40微克的總細(xì)胞裂解液上樣至4％至20％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上。以下抗體用于免疫印跡分析：抗BRAF（14814S），抗pBRAF（絲氨酸445，2696S），抗ERK1 / 2（4695），抗磷酸化ERK1 / 2（蘇氨酸202 /酪氨酸204，9101S），抗MEK1 / 2（9122S）和抗pMEK1 / 2（Ser 217 /221，41G9S）購自Cell Signaling Technologies，抗β-肌動(dòng)蛋白（C4; SC-47778）購自Santa克魯茲 抗體以1：500至1：1000的稀釋度使用?？剐∈螅≒0447）和抗兔（P0448）二抗購自Dako Laboratories，并按1：5000稀釋。使用美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的ImageJ軟件量化條帶強(qiáng)度，并記錄為與上樣對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白的比值。每個(gè)Western blot系列（n）使用來自單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行。使用NIH ImageJ軟件定量印跡強(qiáng)度。

統(tǒng)計(jì)分析

通過使用Prism（GraphPad軟件）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如果僅比較了兩個(gè)條件，我們使用Bonferroni post hoc檢驗(yàn)進(jìn)行單向或雙向方差分析（ANOVA）或采用兩樣本Student t檢驗(yàn)。